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带你认识荧光团和光学滤光片
  • 发布日期:2018-11-07      浏览次数:199
    •   荧光团是一种荧光染料,可作为蛋白质、组织和细胞标记的荧光标记物,以供荧光显微镜进行检测。荧光团的运作方式是吸收特定波长区域(又称为激发能量范围)的能量,然后在其他特定波长区域(又称为发射能量范围)内重新发射该能量。
       
      图1:常见荧光团光谱曲线
       
        一般来说,荧光团会被高频率的照明(紫外、紫色或蓝色光谱区域内的波长)激发或吸收能量,然后会在频率较低的照明(绿色、红色或近红外光谱区域内的波长)中发射该能量。每种荧光团都具备了能够吸收能量的波长,又称为峰值激发波长λ (nm),以及能够将所吸收到的多能量重新发射的对应波长,又称为峰值发射波长λ (nm)。选择单独光学滤光片以及大透射的波长将能够确保您获得清晰度高的荧光图像。
       
        在荧光显微镜应用中,典型的荧光显微镜设置包含了三个滤光片。有关典型荧光显微镜设置,请参阅图2。
       
        滤光片一:激发滤光片
       
        激发滤光片是放置于荧光显微镜的照明路径内。其目的是用于过滤光源中的所有波长,除了受检测荧光团的激发能量范围。滤光片的小透射(%)是决定图像亮度和清晰度的关键。对于任何激发滤光片,我们光学建议使用的小透射为40%,理想的透射为>85%。激发滤光片的带宽应完全出现在荧光团的激发能量范围内,而理想的滤光片的中心波长(CWL)应尽可能与受检测的荧光团的峰值激发波长的长度相近。
       
        由于光密度(OD)是决定滤光片如何截止带宽中波长的衡量标准,因此激发滤光片的光密度是图像背景暗度的关键。我们光学建议使用的小光密度为3.0,理想的光密度为6.0。具备理想的中心波长、小透射(%)以及光密度的光学滤光片能够提供清晰度高的图像,而滤光片的深截止则能够确保检测到微弱的发射信号。
       
        滤光片二:发射滤光片
       
      图2:典型荧光显微镜设置
       
        发射滤光片是放置于荧光显微镜的成像路径内。其目的是用于过滤受检测荧光团的整个激发能量范围,以及透射该荧光团的发射能量范围。对于发射滤光片,我们所建议的小透射、带宽、光密度以及中心波长均与激发滤光片相同。同样的,具备理想的中心波长、小透射(%)以及光密度的发射滤光片能够提供清晰度高的图像,而滤光片的深截止则能够确保检测到微弱的发射信号。
       
        滤光片三:二向色性滤光片或分光器
       
        二向色性滤光片或分光器是以45°角放置于激发滤光片与发射滤光片之间。其目的是用于将激发信号反射至受检测的荧光团,然后将发射信号透射至检测设备。理想的二向色性滤光片或分光器应能够在大反射率和大透射率之间迅速过渡,激发滤光片带宽的理想反射率为>95%,而发射滤光片带宽的理想透射率为>90%。选择滤光片时,应该将荧光团的相交波长(λ)考虑在内,以确保获得低杂散光和高信噪比的荧光图像。
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